Праймер биология

A) ДНК -раскручивающие белки:

• DNA-A (вызывает расхождение нитей)

• ХЕЛИКАЗЫ (расщепляют цепь ДНК)

• ТОПОИЗОМЕРАЗЫ 1 и 2 (раскручивают свер спирали). Разрывают (3′,5′)-фосфодиэфирные связи.

B) Белки, препятствующие соединению нитей ДНК (SSB -белки)

C) ДНК-ПОЛИМЕРАЗА (катализирует образование фосфодиэфирных связей). ДНК- ПОЛИМЕРАЗА только удлиняет уже существующую нить, но не может соединить два свободных НУКЛЕОТИДА.

D) ПРАЙМАЗА (катализирует образование «затравки» к синтезу).

Е)ДНК-ЛИГАЗА.

5. ПРАЙМЕРЫ — «затравка» для репликации. Это короткий фрагмент, состоящий из РИБОНУКЛЕОТИДТРИФОСФАТОВ (2 — 10). Образование ПРАИМЕРОВ катализируется ПРАЙМАЗОЙ. Действуют ферменты (ТОПОИЗОМЕРАЗЫ), вызывающие раскручивание сверх спирали. SSB-белки препятствуют соединению дочерних цепей. Образуется РЕПЛИКАТИВНАЯ ВИЛКА. Образование дочерних нитей. Этому предшествует образование ПРАИМЕРОВ с помощью фермента ПРАЙМАЗЫ. Действует ДНК-ПОЛИМЕРАЗА и образуется дочерняя нить ДНК. Этот процесс происходит в соответствии с принципом комплиментарности, и синтез идёт от 5′ к 3′ концу синтезируемой нити.

Н а одной из материнских нитей будет строиться непрерывная цепь, а на противоположной нити — цепь из коротких фрагментов (фрагментов ОКАЗАКИ) Удаление ПРАИМЕРОВ с помощью ЭКЗОНУКЛЕАЗЫ.

44. Биосинтез рнк (транскрипция). Условия и этапы транскрипции. Процессинг рнк. Альтернативный сплайсинг

Транскрипция — передача информации с ДНК на РНК (биосинтез РНК). Транскрипции подвергаются только определённые части молекулы ДНК. Эта часть называется ТРАНСКРИПТОНОМ. ДНК эукариот прерывистая: участки, несущие информацию (ЭКЗОНЫ), чередуются с участками, не несущими информацию (ИНТРОНЫ). В ДНК с 5′-конца выделяют ПРОМОТОРНУЮ область — место присоединения РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ. С 3′-конца — ТЕРМИНАТОРНАЯ зона. Эти области не транскрибируются. УСЛОВИЯ ТРАНСКРИПЦИИ.

1. Матрица — 1 нить ДНК. Образуется транскрипционный глазок.

2. Структурные компоненты — РИБОНУКЛЕОЗИД-3-ФОСФАТЫ (АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ).

3. ДНК-зависимая РНК-ПОЛИМЕРАЗА.

ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ ТРАНСКРИПЦИИ.

1. ИНИЦИАЦИЯ. Заключается в присоединении РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ к ПРОМОТОРУ, что приводит к расхождению нитей ДНК. Импульсом к присоединению РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ является присоединение ТВР-белка к TATA-боксу.

2. ЭЛОНГАЦИЯ (удлинение). Соединение РИБОНУКЛЕОЗИДМОНОНУКЛЕОТИДОВ и образование фосфодиэфирных связей между НУКЛЕОТИДАМИ с помощью РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ, которая передвигается вдоль нити ДНК. Присоединение НУКЛЕТИДОВ идет в соответствии с принципом комплиментарности, только будут РИБОНУКЛЕОТИДЫ и — УМФ.

3. ТЕРМИНАЦИЯ (окончание).Заключается в том, что со стороны 3′-конца образованной РНК присоединяется множество (до 200 — 300) АДЕНИЛОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ — поли А. Образуется точная копия гена. АДЕНИЛОВЫЕ НУКЛЕОТИДЫ защищают 3′-конец от действия ЭКЗОНУКЛЕАЗ. С 5′-конца образуется защита, так называемый «САР» (чаще всего УДФ). Эта образовавшаяся копия гена называется ТРАНСКРИПТ.

4. ПРОЦЕССИНГ (созревание).

• Кепирование 5-конца

• Формирование полиадениловой последовательности

• СПЛАЙСИНГ — удаление интронов и соединение ЭКЗОНОВ между собой. Играет важную роль в эволюции организмов,

• Альтернативный СПЛАЙСИНГ- из одной пре-иРНК образуется несколько ИРНК и соответственно несколько белков, что проявляется в разнообразии признаков у организмов.

Репликация ДНК

В естественной репликации ДНК, в качестве праймеров используются короткие цепочки РНК длиной около 12 нуклеотидов, синтезируются ферментомпраймазою. Праймазой может присоединять как рибонулеотиды, так и дезоксирибонуклеотидов, но синтезирует именно фрагмент РНК, поскольку рибонуклеотидов в ядре больше. Эти молекулы РНК позже изымаются и заменяются на ДНК ДНК-полимеразы.

Искусственные праймеры

Многие лабораторных методов биохимии и молекулярной биологии, привлекают использования ДНК-полимеразы, например секвенирования ДНК и полимеразная цепная реакция (ПЦР), требуют праймеров. Праймеры, используемые в этих методах, обычно короткие, химически синтезированные молекулы ДНК длиной 20-30 оснований.

Для ПЦР используют 2 праймеры, которые ограничивают с двух сторон последовательность, размножается. Для повышения специфичности реакции выбирают праймеры длиной 20-30 нуклеотидов, с содержанием Г-Ц пар около 50-60%. Г-Ц пары соединены между собой тремя водородными связями, поэтому они гарантируют лучший и более выборочный связь между праймером и матрицей. Для того, чтобы последовательность праймеров была уникальная и связывалась только с одной матрицей в смеси разных молекул ДНК (например, смесь всех ДНК человека), существуют специальные программы, которые с помощью баз последовательностей ДНК подбирают нужную последовательность нуклеотидов праймера.

Для клонирования последовательностей ДНК часто в последовательности праймеров вводят дополнительные нуклеотиды — сайты рестрикции, по которым режут ферменты рестриктазы. После приумножение нужного участка ДНК в ПЦР, полученные молекулы смешивают с ферментом, который разрезает их, образуя на концах так называемые «липкие концы». Такие конце позволяют легко вставить продукт ПЦР к искусственному ДНК-вектора.